試劑盒優化的具體表現
免疫酶技術(immunoenzymatic technique)也叫酶免疫測定,是通過酶標記抗體或抗原來檢測抗原或抗體的方法,其應用范圍極廣。顯示方法是用酶的特殊底物來處理反應后的標本,通過酶催化底物的顯色反應來測定抗原或抗體的存在,以酶標作定量或定性分析。
近年來,EIA技術取得了顯著的發展,主要表現在以下方面:
1、繼單克隆抗體后的第三代抗體基因工程抗體的應用,明顯地提高了檢測的特異性,基本消除了抗原、抗體間的非特異xing jiao叉反應,保證了分析的準確性??贵w制備技術的進步,使試劑的生產制備得以規?;?,檢測范圍日益擴展,小分子抗原、半抗原的檢測成為事實。
2、分析方式的改進與多樣化提高了試驗的敏感性。
(1)除早期的競爭法,間接法外,又發展了雙抗原夾心法測抗體,偶聯酶標記法測抗原,橋聯酶免疫分析,酶放大免疫分析技術等,后者應用了生物素-親和素系統,底物循環放大系統,酶-抗酶放大系統及酶偶聯放大系統等。
(2)由于酶標記技術的進步,標記酶的應用已從過氧化物酶,擴展到堿性磷酸酶,β半乳糖苷酶,尿素酶,葡萄糖6磷酸脫氫酶,葡萄糖氧化酶,蘋果酸脫氫酶,至今有二十多種酶被應用于EIA ,但應用比較多的仍然是辣根過氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)和堿性磷酸酶(Alkalinephasphotase,ALP)。
(3)酶免疫分析與其它標記免疫分析相結合如與熒光免疫分析(Fluorescence Immunoassay ,FIA)結合形成熒光酶免疫分析(Fluorescence Enzyme Immunoassay ,FEIA),酶促放大時間分辨熒光免疫分析(Enzyme-am-plified time-resolved fluoroimmunoassay ,EATRFIA),EIA與化學發光免疫分析(Chemiluminescence immunoassay,CLIA)結合形成酶—化學發光免疫分析,增強化學發光酶免疫分析(ECLEIA)。EIA與聚合酶鏈反應結合形成的PCR-EIA分析等。
(4)改進固相載體的技術
傳統ELISA應用的固相載體是聚苯乙稀微孔板,聚苯乙烯珠或條,后發展為硝酸纖維素膜、活化濾紙、硅片、尼龍、利用高分子材料合成的各種固相微粒等。為提高固相表面的結合容量,增加結合物的范圍而改造聚苯乙烯的表面,如用化學偶聯法導入功能性醛基、?;?、烷胺基等以更好地與蛋白質,多肽的羧基結合,用位點導向性共價偶聯法引入親和素,蛋白A,多聚賴氨酸等,以牢固地捕獲蛋白或多肽,超平整聚苯乙烯表面的制備,克服了表面粗糙帶來的不均一性,達到平均粗糙度只有2A+的超平整平面,實現了對蛋白的結合容量大,脫附率低,孔間均一性好,使試驗精密度達5%。
應用于雙抗體夾心法時,聚苯乙烯經射線照射后,可以增加其吸附性能特別是對免疫球蛋白的吸附性能。近年美國Corning公司研制成功表面經琥珀酰亞胺酯活化酶標板,其質量達到氨基活化相似水平。
(5)分析方法的創新 如同步ELISA法測定多種抗體是將抗原包被在與微孔相匹配的釘板的釘子上,蓋上釘板的同時與微孔內的所需標本、試劑反應,是又一種改良ELISA。利用抗體和抗抗體能形成多層復合物的特性,將常規二步溫育法改為一步溫育測定法,使檢測時間大為縮短,現在已廣為應用。